产品货号:
SY0810
中文名称:
动物组织直接PCR试剂盒
英文名称:
Animal Tissue Direct PCR Kit
产品规格:
50T|200T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本产品是一款可直接对不同动物组织进行PCR扩增的试剂盒,适应性广、稳定性强、操作简易。可用于动物基因扩增检测、转基因动物基因型鉴定等。
本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系,可以快速的裂解多种动物组织样品并释放出基因组DNA,如昆虫足翅、鼠尾、鼠趾、动物皮肤和内脏等。裂解产物可以用于DNA提取纯化、也可以直接用于PCR反应、也可以在-20℃或以下温度条件下长期保存备用。
本试剂盒中提供的2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)具有很强的扩增兼容性,不需要额外采用纯化提取试剂去除裂解产物中的各种残骸杂质,能直接以待测样品裂解液为模板,进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液,包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,大大简化扩增步骤的操作过程,降低污染机率。
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本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系,可以快速的裂解多种动物组织样品并释放出基因组DNA,如昆虫足翅、鼠尾、鼠趾、动物皮肤和内脏等。裂解产物可以用于DNA提取纯化、也可以直接用于PCR反应、也可以在-20℃或以下温度条件下长期保存备用。
本试剂盒中提供的2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)具有很强的扩增兼容性,不需要额外采用纯化提取试剂去除裂解产物中的各种残骸杂质,能直接以待测样品裂解液为模板,进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液,包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,大大简化扩增步骤的操作过程,降低污染机率。
组分 | 50T | 200T | 说明 |
Lysis Buffer | 10mL | 2×20mL | 动物组织裂解缓冲液,与Proteases配合使用于动物组织裂解。建议保存于2~8℃。 |
Proteases | 100μL | 400μL | 动物组织裂解剂,使用时请勿长久开盖,建议保存于-20℃,避免反复冻融。 |
2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye) | 200μL | 2×1mL | 包含PCR扩增所需要的热启动Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等;已混有溴酚蓝染料作为电泳指示剂,PCR产物可以直接进行电泳。建议保存于-20℃,避免反复冻融。 |
5×PCR Enhancer | 500μL | 800μL | 高GC含量扩增(如大于65%)时推荐使用。建议保存于-20℃,避免反复冻融。 |
- 样本裂解
- 在离心管中加入200μL Lysis Buffer和2μL Proteases,轻轻涡旋混匀。
- 取约10mg(长度2mm左右)动物组织,置于上述离心管中,轻轻涡旋混匀。
注:建议使用新鲜采取的动物组织,若为长期冷冻组织,应尽量避免反复冻融,否则会导致模板的降解,影响PCR效率。 - 55℃孵育5~30min,然后95℃处理5min。
- 12000rpm离心2min。
- 将上清转移至新的离心管,-20℃保存或直接用于PCR扩增。
注:- Lysis Buffer与Proteases混合后尽快使用,不宜长期保存;大量样本操作时,可以将Lysis Buffer与Proteases按100μL:1μL的比例混匀备用。
- 组织应取少量并尽量剪碎,以便裂解反应更顺利进行。各组织推荐使用量:
样本类型 用量 鼠尾 长度2~4mm 鼠趾 1~4个 鼠脏器、脑 直径2~4mm 斑马鱼、线虫、果蝇等昆虫组织 1~4个 细胞数量 105~108个
斑马鱼、线虫、果蝇等较小样本的组织,可适当减少Lysis Buffer至50~100μL。昆虫等外壳坚硬的样本,建议剪碎样本并增加Proteases至4μL。 - 55℃孵育,一般5min即可满足多数PCR需求,如鼠尾、鼠耳等组织;若需要的DNA量较大或样品较难裂解,可将时间延长至30min或更久;裂解时间可在5~30min之间调整,组织块不需完全裂解,残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
- Lysis Buffer与Proteases混合后尽快使用,不宜长期保存;大量样本操作时,可以将Lysis Buffer与Proteases按100μL:1μL的比例混匀备用。
- 在离心管中加入200μL Lysis Buffer和2μL Proteases,轻轻涡旋混匀。
- 配制反应体系
按下表配制PCR反应体系,各组分使用前应充分混匀:成分 用量 终浓度 2×Tissue Direct PCR Mix(With Dye) 10μL 1× Forward Primer(10μM) 0.5μL 0.25μM Reverse Primer(10μM) 0.5μL 0.25μM 裂解产物(DNA模板) 2μL - 无菌超纯水 至20μL -
注:- 模板使用量:建议总体系的5~20%之间,避免超过总体系的20%。
- 引物终浓度:反应性能较差时,推荐在0.1~0.5μM范围内调整引物浓度。
- 反应体系:推荐使用20μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
- 体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。
- 对照反应:建议进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
- 模板使用量:建议总体系的5~20%之间,避免超过总体系的20%。
- 设置反应程序
过程 温度 时间 循环数 预变性 94℃ 5min 1 变性 94℃ 10sec 35 退火 60℃ 20sec 延伸 72℃ 20sec 终延伸 72℃ 5min 1
注:退火温度请参考引物的理论Tm值,退火温度可设置低于引物理论值5℃,或通过梯度PCR确定最佳温度。
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2×PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。 | 不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。 | 使用新鲜的试剂。 |
加入组织裂解液过量。 | 增大反应体系,或减少裂解液的用量。 | |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液可在4℃保存2~3天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系5~20%范围内优化模板加入量。 | |
PCR循环数不足。 | 适当增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5~10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 提高PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。 |
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